血中ホモシステイン酸がＭＣＩを検出できる。予備試験結果

Tohru Hasegawa1, Yoshinori Kosoku2, Yuka Sano2, Hiroshi Yoshida2, Chiaki Kudoh3,and Takeshi Tabira3,4
1. Saga Women’s Junior College, 845-0024, Saga, Japan
2. R&D Center, Nipro Co., 525-0055, Kusatsu, Shiga, Japan
3. KUDOH Clinic for Neurosurgery and Neurology, 143-0016, Ota-ku, Tokyo, Japan
4. Graduate School of Medicine, Juntendo University, 113-8421, Bunkyo-ku, Tokyo,Japan

論文（日本語バージョン）

アブストラクト

アルツハイマー病の治療において早期かつ軽度の段階で治療することが重要です。
また、早期診断マーカーは低侵襲で費用対効果の高い血液ベースのバイオマーカーが望ましいです。
現在、脳のアミロイドβの蓄積と血漿中のアミロイドの関連が示されており、アミロイドβ1-42 による診断がアルツハイマー病の早期診断において有用な指標であるとされています。

しかしながら、アミロイドβの蓄積が必ずアルツハイマー病の発症につながるとは証明されていません。

我々は本論文でホモシステイン酸がアルツハイマー病の早期マーカーとして有用であることを示しました。
33 人の血漿のホモシステイン酸、TNF-α、コルチゾール、ACTH、タウ、リン酸化タウ濃度を測定しました。
血漿ホモシステイン酸は MCI と NC の鑑別においてとてもたかいAUCを示しました(0.116μMをカットオフとした時感度91.7％、特異度77.8％)。

一方 MCI と AD の鑑別においては従来のマーカーであるタウ・リン酸化タウが高い AUCを示し(それぞれ 17.0pg/mL,5.9pg/mL の時、感度 83.3％,91.7%、特異度 91.7%,75.0%)、MMSE との相関があることも確認できました。

我々の結果は血漿中のホモシステイン酸濃度が脳の傷害を示す血漿中タウ・リン酸化タウよりも早期に上昇することを示唆しており、アルツハイマー病の早期診断において有用な指標となる可能性を示唆しています。
ホモシステイン酸は NMDA 受容体を過剰活性させる酸化ストレス物質であり、アルツハイマー病において NMDA 受容体の過剰活性がアミロイドの重合とタウのリン酸化を促進することが知られていることからアミロイドよりも上流にあると考えられ、アルツハイマー病の原因物質である可能性が考えられます。

そのため、治療ターゲットとしても有用である可能性も考えられます。

序文

認知症の治療では早期発見・早期治療が重要とされ、抗アミロイド抗体治療では超早期であるアミロイドの蓄積が始まる前に治療を検討する研究などが検討されています(参考論文)。

一方でアミロイド病理を何が引き起こすのか、アミロイド病理とタウ病理は何がつなぐのかはよく分かっていませんでした。
最近の研究において NMDA 受容体はアミロイドと相互作用しており、アミロイドの産出やオリゴマー化に何かしらの役割を持っていること、NMDA 受容体の過剰活性がタウのリン酸化を引き起こしている可能性が示されました(論文)。

しかしながらなにが NMDA 受容体の過剰活性を引き起こすのかその詳しい機序は分かっていません。
そこで我々はより早期にアルツハイマー病を発見できる因子として、NMDA 受容体の過剰活性を引き起こす可能性があり、血液での測定が可能なバイオマーカーを探索しました。

我々は酸化ストレスにより産出される酸化物質であるホモシステイン酸に着目しました。
ホモシステイン酸はメチオニンやホモシステインが酸化されることによって生じるグルタミン酸の類似物質であり、低濃度で NMDA 受容体を過剰活性させ、非常に高い脳毒性を示します。

我々はこれまでアルツハイマー病モデルマウスにおけるホモシステイン酸抗体治療の有用性(参考論文)、認知症患者における血漿ホモシステイン酸濃度の上昇を報告し、アルツハイマー病とホモシステイン酸の関係性を示してきました。
今回我々はアルツハイマー病の早期診断におけるホモシステイン酸測定の有用性について明らかにしました。

方法

本研究には AD12症例、MCI12症例、NC9名の結果が含まれます。
本研究はくどうちあき脳神経外科の倫理委員会承認の下実施されました。

AD については DSM-5 の基準を満たし、脳画像等でアルツハイマー病の症状が見られるもの、MCI についてはロナルド・ピーターセン博士による MCI の以下の５つの定義(7)を満たすことを基準とし、陰性コントロールには中枢神経系の器質的疾患が存在せず、MMSE28~30 の人を選定しました。

実験に使用した患者血液の採取は 2mL ヘパリン管、2mLEDTA 管で実施しました。
血液は約 1500G で 10 分遠心後、血漿をチューブに分注し-20℃で凍結保存しました。

本実験では ELISA 法によって TNF-α、コルチゾール、ACTH を測定し、CLIA 法によってホモシステイン酸、タウ、リン酸化タウを測定しています。
TNF-α測定は Human TNF-alpha Quantikine HS ELISA KIT(R&D,HSTA00E)を使用し添付文書に従って測定をしました。
コルチゾール測定は CORTISOL ELISA KIT(AlphaDiagnostic,1850)を使用し添付文書に従って測定をしました。

ACTH 測定は ACTHELISA(mdbio,M046006)を使用し添付文書に従って測定をしました。
ホモシステイン酸測定の材料として自作の抗原結合プレートと ALP 標識抗を使用しました。
抗原結合プレートの抗原としてホモシステイン酸と BSA をグルタルアルデヒドにより結合させた BSA 結合ホモシステイン酸を使用しました。
作製した BSA 結合ホモシステイン酸をポリスチレン樹脂製プレートに固定し、抗原結合プレートを作製しました。
標識抗体液は市販のホモシステイン酸認識抗体に ALP で標識し、標識抗体を作成し、PBS で希釈しました。
ホモシステイン酸測定では血漿 50μL と PBS50μL、標識抗体液 100μL を混合し、反応させました。
混合液を抗原結合 ELISA プレートに添加し、反応後、洗浄バッファーで洗浄しました。
洗浄バッファー除去後発光基質で発光させ、発光の減少をプレートリーダーで測定しました。
標準液には BSA 結合ホモシステイン酸を使用し測定値に換算しました。

タウ・リン酸化タウ測定の材料として抗体結合磁性粒子と ALP 標識抗体を使用しました。
tau 測定の磁性粒子では全長 tau441 のアミノ酸配列 16-24 を認識する抗体を磁性粒子に結合させました。
p-tau 測定の磁性粒子ではリン酸化タウ 181 のリン酸化部位を認識する抗体を磁性粒子に結合させました。
tau 測定の標識抗体では tau441 のアミノ酸配列 218-221 を認識する抗体を ALP で標識しました。
-tau 測定の標識抗体では tau441 のアミノ酸配列 16-24 を認識する抗体を ALPで標識しました。

タウ・リン酸化タウの測定では 12.5μL 血漿を PBS で 4 倍希釈し、50μL 標識抗体、50μL 磁性粒子を加えた。
B/F 分離後洗浄液によって洗浄し、100μAPS-5で発光させ、ALP の発光の増加を測定した。
標準液としてタウ測定試薬はリコンビナントタウ 441 を使用し、測定値に換算しました。
リン酸化タウ試薬は抗原部位のペプチドを使用し、ペプチド濃度を測定値に換算しました。

結果

テーブル 1 は、33 人の血漿(AD12 名、MCI12 名、NC9 名)について、血漿中のホモシステイン酸、TNF-α、コルチゾール、ACTH、タウ、リン酸化タウを測定した結果です。

はじめに MMSE と測定値の相関係数を確認し、血漿マーカーと認知機能低下の関係を評価しました。
TNF-α、ホモシステイン酸は中程度の相関があり、タウ・リン酸化タウは強い相関がありました。

この結果は、血漿タウおよび p-タウの測定値の増加が認知機能低下と関連していることを示しました。
一方、TNF-αと HCA の測定値は、認知機能が低下する前に増加するように見えました。

つぎに測定値と診断を比較しました。NC と MCI の鑑別、MCI と AD の鑑別を見ると NCと MCI の鑑別では HCA のみ有意差があり、MCI と AD の鑑別ではタウ・リン酸化タウにおいて有意差がありました。

この結果は、血漿 HCA の測定値は MCI の段階で大きく増加し、血漿タウ・リン酸化タウの測定値は AD の段階で大きく増加することを示しました。
それぞれの項目について MCI の診断、AD の診断に有用か ROC 解析により確認した。

ROC解析を行った結果、ホモシステイン酸測定は NC と MCI の鑑別において高い AUC を示しました。
カットオフを 0.116μM とすると感度 92%特異度 78％でした。
ホモシステイン酸が MCI の診断に有用という結果でした。

MCI と AD の鑑別においては従来のマーカーであるタウ・リン酸化タウが高いAUCを示しました。
それぞれカットオフを19.0pg/mL,5.9pg/mL とすると感度 83.3%,91.7％、特異度 91.7%,75.0％となりました。
ADの診断にはタウ、リン酸化タウが有用でした。

考察

HCA の測定値は MCI の段階で増加し、MCI の診断として有用であるため、アミロイドと同様に、血漿 HCA レベルは AD の初期マーカーとして有用であることが示唆されました。

一方、血漿タウと p-tau の測定値は認知機能低下と関連があり、AD の診断に役立つため、血漿タウと p-tau は疾患の進行を確認するマーカーとして有用であることが示唆されました。

我々の結果では、血漿 HCA レベルは、Aβのように血漿タウおよび p タウレベルよりも早く上昇します。
ホモシステイン酸が NMDA 受容体を過剰活性させる能力を持つことを考えると、次のようなモデルが考えられます。

そのモデルは、血中のメチオニンやホモシステインがストレスなどによって酸化され、ホモシステイン酸になり、血液中のホモシステイン酸濃度が増えるに従って脳の NMDA 受容体が過剰活性され、アミロイドの重合やタウのリン酸化が促進され、認知機能が低下するというものです。

ホモシステイン酸がこの役割を持つとすると、ホモシステイン酸はアミロイドβよりも上流のアルツハイマー病の原因物質であり、アルツハイマー病の早期発見のターゲットとしてはもちろん、治療ターゲットとしても有用である可能性が考えられます。

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ホモシステインは必須アミノ酸のメチオニンが代謝されて生成されるアミノ酸です。
ホモシステインが増えるにつれて悪玉コレステロールと結合し、動脈硬化の原因にもなります。

これまで世界の学者達がホモシステインと認知機能障害に関して研究を行った結果、
ホモシステインはホモシステイン酸のように細胞を死滅させてしまう程の悪性はなく、
ホモシステインを減少させても認知機能障害は改善しないといった発表がされてきました。

しかし、ネズミにメチオニンを多量に投与した結果、
ホモシステイン酸が形成され、認知記憶障害とまったく同じような症状を引き起こしたことから、
ホモシステイン酸が認知記憶障害の原因物質であることがわかってきました。

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ホモシステイン酸が作用する部位の一つにNMDA受容体というものがあります。

NMDAにはSNMDA受容体とeMNDA受容体の2種類があり、
eNMDA受容体が細胞の老化を引き起こし、脳神経細胞は死んでいき、
認知障害を引き起こすことが理解されてきました。

そして、そのeMNDA受容体にホモシステイン酸は作用します。

血中のホモシステイン酸の濃度が増えるにしたがって、
MMSE※の数値が下がってくることも確認されています。

※世界の標準としての指標である、MMSE検査のこと。

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